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        滲透壓對CHO細胞生長(cháng)、細胞體積、抗體產(chǎn)率及糖基化的影響

        2024-01-15 09:46:04


        滲透壓對CHO細胞生長(cháng)、細胞體積、抗體產(chǎn)率及糖基化的影響

        1、介紹

        中國倉鼠卵巢(CHO)細胞的培養滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)和細胞體積與特定的重組蛋白生產(chǎn)力相關(guān),生物合成能力和營(yíng)養交換取決于細胞大小,而細胞大小又受到培養物滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)的影響,已知高滲條件會(huì )導致細胞體積增加。

        細胞大小是特定蛋白質(zhì)生產(chǎn)力的決定因素。盡管每個(gè)細胞周期階段的細胞都具有生產(chǎn)力,但G2/M期的細胞表現出最高的生產(chǎn)力。
        在某些研究中,滴度的增加伴隨著(zhù)蛋白質(zhì)質(zhì)量的變化,特別是在
        糖基化方面,已經(jīng)發(fā)現高滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)可以降低Fc融合蛋白的N-糖中酸性異構體和唾液酸含量的比例,這可以通過(guò)添加甜菜堿來(lái)避免。
        同樣,在補料分批培養階段,滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)濃度增加
        60-120mOsm/kg會(huì )導致未充分加工的聚糖的分泌。

        2、結果和討論

        一、高滲透壓對細胞生長(cháng)和代謝的影響

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        1:中國倉鼠卵巢(CHO)細胞的最大生長(cháng)速率與細胞外滲透壓的函數關(guān)系。

        我們在接種前向培養基中加入NaCl或補料C,以獲得320500 mOsm kg?1之間的初始滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)值。如圖1所示,在這兩種情況下,滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)的增加導致最大特定細胞生長(cháng)率顯著(zhù)降低。兩種處理方式的最大生長(cháng)率差異無(wú)統計學(xué)意義(p>0.05)。

        不同滲透壓條件下細胞培養參數隨時(shí)間的變化曲線(xiàn)

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        活細胞密度曲線(xiàn)如圖2A所示隨著(zhù)鹽或補料的添加滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)濃度增加,生長(cháng)速率明顯降低。這些發(fā)現表明,添加補料會(huì )嚴重抑制細胞生長(cháng),在(添加補料C)滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)達到500 mOsm kg?1的情況下可以清楚地看到這一點(diǎn)。在培養過(guò)程中,滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)值增加(圖2B),主要是由于細胞外乳酸、Na+K+的積累(圖2,分別為E、GH)。

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        直到第5天,平均細胞直徑與滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)呈正相關(guān)(圖2C),其值在接種后24小時(shí)快速增加,特別是對于添加補料C超過(guò)410 mOsm kg?1與對照組相比非常明顯。然而,從第6天開(kāi)始,當對照和添加NaCl的培養物中的葡萄糖和谷氨酸等關(guān)鍵營(yíng)養物質(zhì)開(kāi)始耗盡時(shí),趨勢發(fā)生了變化(圖2F、2I)。

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        氨濃度(2D)呈逐漸增加的趨勢,但只有3種條件超過(guò)5mM,對該細胞系[36]有明顯的抑制作用。然而,在所有情況下,這一閾值是在靜止期或后期培養,很可能不損害達到高峰細胞密度。圖2E,F分別顯示細胞外乳酸菌和葡萄糖的分布,其中前者從產(chǎn)生到消耗的轉變僅在對照和320mOsmkg-1條件下進(jìn)行。其余的培養物在整個(gè)培養過(guò)程中表現出持續的乳酸產(chǎn)生,在一些添加NaCl的培養物中,乳酸似乎來(lái)自葡萄糖以外的其他來(lái)源。從乳酸產(chǎn)生到消耗的轉變被認為取決于培養液的pH值。

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        圖3 不同滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)條件下(A)氨、(B)葡萄糖、(c)谷氨酸、(D)谷氨酰胺和(E)乳酸的特定攝取/產(chǎn)生速率。對照培養物未產(chǎn)生可檢測水平的谷氨酰胺。誤差條表示兩個(gè)平行實(shí)驗的標準偏差。對于顯著(zhù)性分析(*p<0.05),假設不同實(shí)驗之間每個(gè)變量的方差相等.

        3顯示了指數生長(cháng)階段(即根據第0天至第6天的數據計算)我們觀(guān)察到了恒定的滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)值。與對照組相比,所有培養物的特定葡萄糖消耗率都較高,盡管表現出較低的特定細胞生長(cháng)率。無(wú)論隨后的高滲處理如何,隨著(zhù)滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)的增加,葡萄糖上的乳酸產(chǎn)量都更高,這表明無(wú)論誘導方法如何,碳代謝都不充分。先前已經(jīng)報道,在較高的殘留葡萄糖濃度下,葡萄糖上的乳酸產(chǎn)量增加。事實(shí)上,我們的實(shí)驗結果指向相同的表型。比較使用相同誘導方法的培養物之間的殘留葡萄糖濃度(圖2F),我們發(fā)現葡萄糖濃度越高,在細胞生長(cháng)期(兩天的初始適應期,隨后是指數細胞生長(cháng))內乳酸的產(chǎn)生率就越高(圖3E)。這種行為在培養后期仍在繼續,在正常滲透壓條件下(對照和370mOsm kg?1 NaCl)的兩種培養物顯示出乳酸濃度的快速下降,這是由于細胞將代謝產(chǎn)物作為碳源重新內化所致(圖2E)。在加入NaCl的最高滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)培養物的情況下,產(chǎn)生的乳酸鹽的一部分似乎來(lái)自糖酵解以外的來(lái)源。先前有報道稱(chēng),谷氨酸解酶可以在癌癥細胞中提供碳和氮,已知這些細胞與CHO細胞具有相似的代謝特征。有趣的是,當滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)值在410-420mOsm kg?1范圍內時(shí),在兩種高滲誘導策略下,氨的產(chǎn)生率沒(méi)有顯著(zhù)差異。然而,這種變化在460–470 mOsm kg?1范圍內,其中NaCl培養物表現出顯著(zhù)更高的氨生成率(p<0.05)。具體而言,添加NaCl的培養物比添加補料C的實(shí)驗分泌更多的氨(圖3A)。這與各自的谷氨酰胺生產(chǎn)速率一致,后者使用氨合成和分泌谷氨酰胺的速率高于前者(圖3D)。然而,谷氨酸的攝取/生產(chǎn)速率并不遵循相同的模式,460–470 mOsm kg?1范圍內的NaCl培養物消耗谷氨酸,而補料C培養物分泌谷氨酸。鑒于補料C富含氨基酸,我們假設這些培養物將其他氨基酸轉化為谷氨酸,然后用于合成谷氨酰胺。有趣的是,500 mOsm kg?1的培養物表現不同,表現出氨和谷氨酸產(chǎn)量增加,谷氨酰胺分泌減少,表明在這些高滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)、營(yíng)養豐富的條件下有不同的代謝途徑。

        二、高滲壓對滴度和特異性抗體生產(chǎn)率及糖基化的影響

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        圖4顯示了所有培養物收獲時(shí)的mAb滴度和各自的整體活細胞密度(IVCD)值。最高滴度為410 mOsm kg?1,添加補料C也顯示出最高的IVCD,盡管后者與對照培養物沒(méi)有顯著(zhù)差異。在另一端,500 mOsm kg?1補料C培養物的IVCD和mAb滴度最低??偟膩?lái)說(shuō),滴度大致遵循與IVCD相同的趨勢,470 mOsm kg?1 NaCl培養物除外。從圖5中的特定mAb生產(chǎn)力我們可以看到,在所有條件下,470 mOsm kg?1 NaCl培養物的mAb分泌率最高。這不僅高于對照培養物,而且明顯高于所有添加補料C培養物。有趣的是,補充N(xiāo)aCl的培養物顯示出特定mAb生產(chǎn)力的增加,這與滲透壓值呈正相關(guān),而添加補料C的培養物在三種不同的滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)值之間沒(méi)有統計學(xué)上的顯著(zhù)差異。這可能源于后一種培養物由于葡萄糖豐度高,對營(yíng)養物質(zhì)的利用效率較低。此外,470 mOsm kg?1 NaCl和410 mOsm kg?1補料C培養物在第6天后表現出明顯更大的細胞直徑,如圖2C所示。

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        兩種高滲誘導方法對收獲時(shí)mAb糖基化的影響如圖6所示。在添加NaCl的培養物中,聚糖分布沒(méi)有統計學(xué)上的顯著(zhù)差異(p>0.05)。然而,添加更多補料C的培養物顯示,隨著(zhù)滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)的增加,G0F下降(410500 mOsm kg?1之間的差異為18%)。這伴隨著(zhù)G0的增加(410500 mOsm kg?1之間的差異為10%)和半乳糖基化百分比的較小增加(G1F、G10FG2F)。然而,毫不奇怪,表現出最高物種生產(chǎn)力(410 mOsm kg?1補料c)的培養物也顯示出非半乳糖基化的百分比增加。另一方面,抗體合成和分泌的高速率可能限制了抗體在高爾基體中的停留時(shí)間,因此降低了負責mAb半乳糖基化的b-1,4-半乳糖基轉移酶(b4GalT)對聚糖的進(jìn)一步加工程度。與預期的非半乳糖基化結構的分布增加相反,核心巖藻糖基化在培養物中表現出意想不到的行為,包括添加補料C以調節滲透壓。如圖6所示,最高滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)條件(500 mOsm kg?1補料C)的核心巖藻糖基化水平明顯低于410 mOsm kg?1補料C樣品(p<0.05),盡管其特異性抗體生產(chǎn)率較低。上述觀(guān)察結果可能表明,由于較高的滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)水平,a-1,6-巖藻糖基轉移酶(FucT)酶活性受到抑制或基因(Fut8)表達減少,假設核心巖藻糖化的共底物GDP巖藻糖的水平不受滲透壓變化的影響。

        三、高滲透壓對細胞體積的影響

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        在研究了CHO細胞培養開(kāi)始時(shí)添加補料和鹽誘導的高滲性的影響后,我們在生物反應器中觀(guān)察了一組典型的補料CHO細胞。后者更好地代表了典型的生產(chǎn)條件,在這種條件下,由于營(yíng)養物質(zhì)的補充和代謝物的產(chǎn)生,細胞外滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)比初始值增加了70%,此前有報道稱(chēng),這會(huì )導致細胞體積增加四倍。此外,在生物反應器環(huán)境中,我們可以有效地控制培養物的pH,但也可以探索在指數生長(cháng)期間將溫度轉移到溫和低溫條件的影響,這是延長(cháng)培養時(shí)間和提高產(chǎn)品滴度的常用策略。在我們的生物反應器研究中,代謝在36.5℃時(shí)更活躍、 其中葡萄糖和乳酸兩者比在亞低溫下更容易被消耗。這導致滲透壓摩爾濃度在36.5時(shí)緩慢增加,用于相同的補料計劃(圖7a)。將平均細胞大小繪制為滲透壓濃度的函數,說(shuō)明了滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)濃度對細胞體積的影響(圖7b)。

        結果

        CHO細胞的Fed-Batch培養模式下,補料的添加和代謝產(chǎn)物的積累導致后期培養液物中細胞外滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)的增加。
        通過(guò)
        NaCl調節滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)至470 mOsm/kg時(shí)對抗體產(chǎn)率和滴度具有促進(jìn)作用,但是通過(guò)補加Feed C提高了mAb產(chǎn)率,但細胞生長(cháng)速率顯著(zhù)降低且導致半乳糖基化水平比例顯著(zhù)降低。

        3、結論

        在本研究中,我們檢測了高滲條件對CHO細胞生長(cháng)、細胞體積和抗體產(chǎn)生的影響。我們比較了兩種誘導高滲性的方法,添加NaCl和添加補料C。滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)對細胞生長(cháng)和抗體滴度的影響程度差異很大,取決于滲透壓的值以及增加滲透壓(摩爾濃度滲透壓,摩爾滲透壓)的方法。這是因為,盡管高滲條件在所有條件下都提高了特定抗體的生產(chǎn)力,但它們也對生長(cháng)產(chǎn)生了不利影響,這意味著(zhù)在某些情況下總滴度低于對照。令人驚訝的是,與補充補料C的培養物相比,補充NaCl的培養物表現出更一致的行為,這表明過(guò)量營(yíng)養物添加對生長(cháng)速率的不利影響。

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